How to Set Up een Vrijstaande Patch - Clamp Experiment

De patch - clamp experiment wordt gebruikt om enkele levende cellen te meten. Hij doet dit met een zeer fijne pipet dicht gehouden tegen het membraan van de cel (de buitenste beschermlaag ) . De opening van de pipet is slechts ongeveer 1 micron ( duizendste van een millimeter ) en optisch gecontroleerd met een microscoop . Cellen worden uniform bewaard in een schotel met een cel ontkoppelaar , zoals trypsine . Een specifieke cel wordt gekozen en de pipetpunt wordt op de celmembraan geplaatst . Een goede afdichting wordt gevormd met behulp van zuig- en een deel van het membraan wordt getrokken in de pipette.Things je nodig hebt
celplaat
fosfaat gebufferde zoutoplossing , of PBS ( zonder calcium en magnesium ) op trypsine
incubator
10 - milliliter pipet
HEK ( humane epidermale keratinocyctes ) medium
Foetaal kalf serum ( FCS ) op Centrifuge
Externe opname oplossing
Patch clamp chip
Twist cap
Elektrode
Toon meer instructies
1

Vraag een plaat voor de cellen . Was de plaat tweemaal met 10 ml PBS ( fosfaatgebufferde zoutoplossing ) zonder calcium en magnesium . Voeg 2 ml ontkoppelaar ( trypsine ) . Incubeer de plaat gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius . Let op de plaat onder de microscoop dat de cellen losgemaakt . Beweeg de plaat alle cellen los van de bodem van de plaat . Voeg 10 ml HEK ( humane epidermale keratinocyctes ) en FCS ( foetaal koe serum ) medium . Gebruik een 10 - milliliter pipet om de cellen op en neer bewegen . Kopen van 2

Let op de cellen onder de microscoop om ervoor te zorgen dat ze enkele cellen . Pipetteer met de 10 - ml pipet totdat de cellen enkele, indien nodig. Centrifugeer de cellen twee minuten bij 1000 omwentelingen per minuut . Verwijder het supernatant . Plaats de cellen in 10 ml foetaal kalfsserum . Centrifugeer de cellen opnieuw gedurende twee minuten bij 1000 omwentelingen per minuut . Verwijder het supernatant . Plaats de cellen in 200 microliter van externe opname oplossing . Let op de cellen onder de microscoop voor enkele cellen met een gladde membraan .

Plaats 3 de zoutoplossing in een patch clamp chip . Voeg een druppel intracellulaire elektrolytoplossing van het benedendeel van de chip met een pipet . Monteer de chip op een twist dop . De twist dop moet de referentie-elektrode en zuigleiding bevatten . Voeg een druppel extracellulaire elektrolytoplossing naar de top van de chip met een pipet . De elektrolytoplossing maakt de chip contact met de elektrode te maken . Voeg 5 microliter celsuspensie aan de zoutoplossing in de chip . Plaats een enkele cel met behulp van afzuiging via een pipet . Suction kan handmatig worden uitgevoerd door zuigen lucht door de pipet . Plaatsing van de cel verhoogt de weerstand tegen een afdichting . Het zegel maakt voor het onderzoek van de gehele cel .