GSH testprotocollen
Glutathion of GSH is een eiwit dat voorkomt in zowel planten als dieren . Het werkt om enzym reacties in de detoxificatie van milieuverontreinigende stoffen helpen. Bovendien aminozuurtransport vergemakkelijkt in cellen en helpt eiwit sulfhydryl reductiereacties handhaven . GSH assay protocollen GSH buffers , normen substraat enzymen en reagentia . Naar aanleiding van de specifieke procedure relevant is voor de uitkomst van de test. Enzymatische Recycling-methode
De enzymatische recycling -methode , voor GSH , gebruikt glutathionreductase te kwantificeren GSH . Dit protocol is specifiek voor plasma, weefsel of gekweekte cellen monsters . Voeg de reagens DTNB ( 5 - 5' - dithio - bis - 2 - nitrobenzoëzuur ) aan GSH . De sulfhydrylgroep in GSH reageert met het reagens en produceert een gele zuur genaamd 5 - thio - 2 - nitrobenzoëzuur ( TNB ) . Voeg glutathion reductase aan het zuur en GSH mengsel GSH recyclen en produceren meer zuur. In deze procedure , de snelheid van zuurvorming is evenredig met de recycling reactie van GSH ; Daarom meet de absorptie van de TNB zuur met een spectrofotometer . De absorptie geeft een schatting van het werkelijke bedrag van GSH in de steekproef .
Levercel Glutathion Assay
Dit protocol analyseert de hoeveelheid GSH in menselijke hepatocarcinoma ( leverkanker ) cellen . Om deze procedure uit te voeren , gebruikt u de colorimetrische methode voor GSH vastberadenheid te verminderen en oxideren GSH . Verminder GSH met 5 - 5' - dithiobis ( 2 - nitrobenzoëzuur of DTNB ) de
gekleurd product te vormen 2 - nitro - 5 - thiobenzoëzuur en geoxideerd glutathion ( GSSG ) . Gebruik glutathion reductase verminderen GSSG tot GSH vormen weer . Om het bedrag van GSH in de levercellen te meten , lees het monster bij 415 absorptie kinetisch op een microplaatlezer .
Celapoptosis
In deze protocol GSH gebruikt om apoptose ( dood ) detecteren door het meten van de afname in verminderde GSH . Een lagere concentratie van cellulaire GSH is een indicator van celdood . Vlekken op het monster cellen met niet-fluorescerende thiolite groen . De thiolite groene ophoopt in het cytosol ( cel plasma ) en mitochondria ( powerhouse ) van de cel . Gebruik een flowcytometer op 490/520 nanometer om de hoeveelheid GSH visualiseren in de cellen .
Totale concentratie van GSH in dieren en planten Samples
Meet de concentratie van totale GSH in zowel de gereduceerde en geoxideerde vorm in verschillende dieren en planten monsters . Voeg de algemene thiolreagens , 5 - 5' - dithiobis [ 2 - nitrobenzoëzuur ] . De thiol reagens reageert met GSH tot 412 nm chromofoor , 5 - thionitrobenzoic acid ( TNB ) en GS - TNB vormen . Voeg glutathion reductase en beta - nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat ( NADPH ) GS - TNB verminderen . De glutathion zal ook een tweede TMB molecuul loslaten en recyclen de GSH . Bovendien wordt elke geoxideerde GSH ( GSSG ) aanwezig in het mengsel fromed van de disulfide reactie ook verminderd GSH . Gebruik een microplaataflezer bij 405 nanometer tot de absorptie niveau te lezen en geven de totale concentratie van GSH .