Basale activiteit van de SP6 promotor

In vitro experimenten die uitgevoerd buiten een levend organisme in een reageerbuis of soortgelijke omgeving . Wetenschappers kunnen RNA kopieën of afschriften van een gen in vitro maken door middel van een proces genaamd in vitro transcriptie . Het enzym dat RNA- transcript maakt op basis van het gen wordt een RNA polymerase . Een dergelijk molecuul is het SP6 polymerase . Het vereist een stuk DNA genaamd de SP6 promotor om goed te functioneren . Promoters

promotor regio DNA door een RNA polymerase gebonden aan transcriptie te initiëren . De SP6 polymerase vereist dat een specifieke sequentie in de promoter zijn om te binden , zodat wanneer de SP6 polymerase wordt gebruikt voor in vitro transcriptie , moet het gen de SP6 promoter voor transcriptie optreden bevatten . De SP6 polymerase is van een type van het virus genaamd een bacteriofaag ; biotech bedrijven produceren deze polymerase door het infecteren salmonella bacteriën faag en vervolgens het isoleren van het polymerase .
Expressie

Basale expressie of activiteit verwijst naar het niveau van expressie in de afwezigheid van andere moleculen die verhogen of het niveau van transcriptie verlagen . Activatoren of repressors , bijvoorbeeld , zijn eiwitten die binden aan de promoter of andere gen- regulatoire gebieden en ofwel helpen werven van de RNA- polymerase of voorkomen binden . Inductoren zijn moleculen die de productie van het genproduct te stimuleren door het verhogen van expressie .
SP6

basale activiteit voor de SP6 promotor zal variëren afhankelijk van de omstandigheden van uw experiment . De belangrijkste overweging , is natuurlijk jouw experimentele omstandigheden beïnvloeden activiteit en hoe SP6 vergelijking met andere systemen . In het algemeen , SP6 polymerase en promotors leveren lager rendement dan de T7 of T3 in vitro transcriptie systemen , hoewel onder ideale omstandigheden SP6 is ruwweg vergelijkbaar met die andere twee . Zoals SP6 , zowel T7 en T3 gebruik een RNA-polymerase van bacteriofaag .
Voorwaarden

Zout concentratie en temperatuur zijn twee belangrijke factoren bij het bepalen van basale activiteit . SP6 is zeer gevoelig voor zoutconcentratie , zodat hogere zoutconcentraties kunnen de activiteit sterk verminderen . Alle gelijke resterende anders, expressie is aanzienlijk groter bij 104 graden Fahrenheit dan bij 99 graden Fahrenheit . Nucleotide concentratie een belangrijke overweging . Lage concentraties kan mogelijk transcriptie veroorzaken voortijdig te beëindigen en daarmee uw efficiëntie te verlagen. Het verhogen van de concentratie nucleotide dit probleem te vermijden . Als u synthetiseren RNA sondes echter het toevoegen van te veel niet-gemerkte nucleotide zal de hoeveelheid gelabelde nucleotide in het eindproduct te verlagen .