Hoe de pH van cytoplasma laten

Potentiële waterstof , of pH , is een maat voor de zuurgraad van een vloeistof . Het is belangrijk op vele gebieden, zoals biologie , scheikunde en milieukunde . Meten pH eenvoudig in de meeste situaties . Lakmoespapier kan worden ingebracht in de vloeistof , en de verandering in kleur van het document worden de mate waarin de vloeistof zuur of base . Wanneer de te testen vloeistof wordt in een cel , andere methoden moeten devised.Things Je moet
2 worden ' , 7' - bis - ( 2 = carboxyethyl ) -5 ( en -6 ) - carboxyfluoresceïne ( BCECF ) , of andere stof met wisselende fluorescentie onder verschillende pH-omstandigheden
fluorescentie spectrofotometer met dubbele monochromatoren of soortgelijk instrument voor het meten van fluorescentie
Centrifuge
Vooraf kalibratiecurven meten correlatie van intracellulaire BCECF en cytoplasmatische pH

Toon meer instructies
1

Koel de temperatuur van de cel monster tot 41 tot 50 graden Fahrenheit . Dit maakt een betere absorptie van het fluorescente materiaal door de cellen .

Laad Pagina 2 het celmonster met een fluorescentie- inducerende substantie zoals BCECF . Dit wordt gedaan door de BCECF het celmedium en vervolgens roeren van het mengsel langzaam gedurende 2,5 uur . De BCECF wordt geabsorbeerd door het permeabel membraan van de cellen .
3

Scheid de cellen van het medium en de nog niet opgenomen BCECF door het uitvoeren van het monster door een centrifuge . Plaats de cellen in een afzonderlijke houder .
4

Verwarm het celmonster 98,6 graden Celsius gedurende 30 minuten , aan de omstandigheden in het menselijk lichaam te benaderen . Als de cellen te onderzoeken normaal in een andere omgeving te leven dan het menselijk lichaam , pas het monster op de juiste temperatuur .
5

Excite de cel monster door roeren . Dit helpt om de fluorescente activiteit te verhogen .
6

Meet fluorescentie-intensiteit van het celmonster met de spectrofotometer . Voor het beste resultaat , gebruik excitatie licht bij golflengten van 500-510 nanometer. Op deze golflengten is er een grotere spreiding van fluorescentie-intensiteit , zodat het gemakkelijker is om de resultaten te differentiëren . De fluorescentie-intensiteit wordt gemeten in relatieve fluorescente eenheden ( RFU ) , een verhouding van de helderheid van de stof in een opgewonden , fluorescerende staat om de normale , niet-aangeslagen toestand. Hoe hoger de RFU , hoe helderder de stof , in vergelijking met de normale toestand.
7

Vergelijk spectrofotometer resultaten pre- getrokken ijkcurves . In het algemeen hogere fluorescente betekent hogere pH in het monster . Met een golflengte van 510 nm , zou een stof met een pH van 6,4 een RFU van ongeveer 20 tonen , terwijl een stof met een pH van 9,9 een RFU van ongeveer 55 zou laten zien .